Pred experimentom by mali byť všetky činidlá a vzorky vyvážené na izbovú teplotu; po pretavení by sa vzorky mali znova odstrediť a odobrať supernatant na testovanie; pre reagencie alebo prípravu vzoriek zmiešajte a vyhnite sa peneniu; kalibrácia a vzorky sa odporúčajú na duplicitné testovanie.

1. Pridajte ple: pridajte štandardný pracovný roztok postupne do prvých dvoch jamiek a pridajte dva otvory pre každú koncentráciu pracovného roztoku, 100 μ L každej jamky. Vzorky na testovanie sa pridajú do iných jamiek, 100 μ L na jamku (pre koncentráciu vzorky nad testovací rozsah, vzorka zriedená štandardom a riedením vzoriek). Mikroplatnička bola potiahnutá filmom a inkubovaná pri 37 °C ℃ počas 90 min. Tip: Pri pridávaní vzorky na spodok mikroplatničky sa snažte nedotknúť steny otvoru, jemne pretrepte a premiešajte, aby ste predišli tvorbe bublín. Dodatočný čas by sa mal kontrolovať do 10 minút.

2. Biotinylovaná protilátka/antigén: zlikvidujte kvapalinu a pretrepte dosucha, bez premývania. 100 ul pracovného roztoku biotinylovanej protilátky/antigénu sa okamžite pridalo do každej jamky, premiešalo sa, mikrodoštička plus pokryla film a inkubovala sa pri 37 °C počas 1 hodiny.

3. Umývanie: pretrepte kvapalinu v otvore, pridajte 350 μl premývacej kvapaliny do každej jamky, namočte na 1-2 minúty, odsajte alebo vytraste kvapalinu z mikroplatničky a vysušte na hrubom sacom papieri. Opakujte tento krok premývania platne 3-krát. Tip: Práčku môžete použiť tu aj v iných krokoch prania. Každý krok umývania je pre experiment nevyhnutný.

4. Konjugát enzýmu HRP: 100 μ L pracovného roztoku enzýmového konjugátu na jamku, zmiešaný, potiahnutý filmom a inkubovaný pri 37 °C ℃ po dobu 30 minút.

5. Premývanie: vylejte kvapalinu do jamky a 5-krát umyte platňu rovnakým spôsobom ako v kroku 3.

6. Substrát: do každej jamky pridajte 90 μl roztoku substrátu (TMB), dobre premiešajte, pridajte filmový povlak a inkubujte pri 37 °C približne 15 minút. Poznámka: Inkubačný čas by sa mal skrátiť alebo predĺžiť podľa aktuálnej situácie vývoja farby, ale nie viac ako 30 minút. Môže sa ukončiť, keď sa v štandardnom otvore objaví jasný gradient.

7. Ukončenie: Pridajte 50 μ 1 ukončovacieho roztoku do každej jamky na ukončenie reakcie. Poznámka: Poradie pridávania ukončovacieho roztoku by malo byť rovnaké ako poradie pridávania roztoku substrátu.

8. Odčítanie: Okamžite zmerajte optickú hustotu (OD) každej jamky pri 450 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek. Čítačka mikrodoštičiek by sa mala otvoriť vopred, aby sa nastavil testovací postup.

9. Po ukončení experimentu vložte nespotrebované činidlo späť do chladničky podľa určenej skladovacej teploty až do doby trvanlivosti.